色譜法，又稱(chēng)層析法。根據其分離原理，有吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜等方法。 吸附色譜是利用吸附劑對被分離物質(zhì)的吸附能力不同，用溶劑或氣體洗脫，以使組分分離。常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等有吸附活性的物質(zhì)。 分配色譜是利用溶液中被分離物質(zhì)在兩相中分配系數不同，以使組分分離。其中一相為液體，涂布或使之鍵合在固體載體上，稱(chēng)固定相；另一相為液體或氣體，稱(chēng)流動(dòng)相。常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。 離子交換色譜是利用被分離物質(zhì)在離子交換樹(shù)脂上的離子交換勢不同而使組分分離。常用的有不同強度的陽(yáng)、陰離子交換樹(shù)脂，流動(dòng)相一般為水或含有有機溶劑的緩沖液。 排阻色譜又稱(chēng)凝膠色譜或凝膠滲透色譜，是利用被分離物質(zhì)分子量大小的不同和在填料上滲透程度的不同，以使組分分離。常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等，可根據載體和試樣的性質(zhì)，選用水或有機溶劑為流動(dòng)相。 色譜法的分離方法，有柱色譜法、紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法等。色譜所用溶劑應與試樣不起化學(xué)反應，并應用純度較高的溶劑。色譜時(shí)的溫度，除氣相色譜法或另有規定外，系指在室溫下操作。 分離后各成分的檢出，應采用各單體中規定的方法。通常用柱色譜、紙色譜或薄層色譜分離有色物質(zhì)時(shí)，可根據其色帶進(jìn)行區分，對有些無(wú)色物質(zhì)，可在245-365nm的紫外燈下檢視。紙色譜或薄層色譜也可噴顯色劑使之顯色。薄層色譜還可用加有熒光物質(zhì)的薄層硅膠，采用熒光熄滅法檢視。用紙色譜進(jìn)行定量測定時(shí)，可將色譜斑點(diǎn)部分剪下或挖取，用溶劑溶出該成分，再用分光光度法或比色法測定，也可用色譜掃描儀直接在紙或薄層板上測出，也可用色譜掃描儀直接以紙或薄層板上測出。柱色譜、氣相色譜和液相色譜可用接于色譜柱出口處的各種檢測器檢測。柱色譜還可分部收集流出液后用適宜方法測定。柱色譜法 所用色譜管為內徑均勻、下端縮口的硬質(zhì)玻璃管，下端用棉花或玻璃纖維塞住，管內裝有吸附劑。色譜柱的大小，吸附劑的品種和用量，以及洗脫時(shí)的流速，均按各單體中的規定。吸附劑的顆粒應盡可能保持大小均勻，以保證良好的分離效果，除另有規定外通常多采用直徑為0.07-0.15mm的顆粒。吸附劑的活性或吸附力對分離效果有影響，應予注意。 吸附劑的填裝 干法：將吸附劑一次加入色譜管，振動(dòng)管壁使其均勻下沉，然后沿管壁緩緩加入開(kāi)始層析時(shí)使用的流動(dòng)相，或將色譜管下端出口加活塞，加入適量的流動(dòng)相，旋開(kāi)活使流動(dòng)相緩緩滴出，然后自管頂緩緩加入吸附劑，使其均勻地潤濕下沉，在管內形成松緊適度的吸附層。操作過(guò)程中應保持有充分的流動(dòng)相留在吸附層的上面。濕法：將吸附劑與流動(dòng)相混合，攪拌以除去空氣泡，徐徐傾入色譜管中，然后再加入流動(dòng)相，將附著(zhù)于管壁的吸附劑洗下，使色譜柱表面平整。 俟填裝吸附劑所用流動(dòng)相從色譜柱自然流下，液面將柱表面相平時(shí)，即加試樣溶液。 試樣的加入 除另有規定外，將試樣溶于層析時(shí)使用的流動(dòng)相中，再沿色譜管壁緩緩加入。注意勿使吸附劑翻起?；驅⒃嚇尤苡谶m當的溶劑中。與少量吸附劑混勻，再使溶劑揮發(fā)去盡后使呈松散狀；將混有試樣的吸附劑加在已制備好的色譜柱上面。如試樣在常用溶劑中不溶解，可將試樣與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入。 洗脫 除另有規定外，通常按流動(dòng)相洗脫能力大小，遞增變換流動(dòng)相的品種和比例，分別分部收集流出液，至流出液中所含成分顯著(zhù)減少或不再含有時(shí)，再改變流動(dòng)相的品種和比例。操作過(guò)程中應保持有充分的流動(dòng)相留在吸附層的上面。紙色譜法 以紙為載體，用單一溶劑或混合溶劑進(jìn)行分配。亦即以紙上所含水分或其他物質(zhì)為固定相，用流動(dòng)相進(jìn)行展開(kāi)的分配色譜法。 所用濾紙應質(zhì)地均勻平整，具有一定機械強度，必須不含會(huì )影響色譜效果的雜質(zhì)，也不應與所用顯色劑起作用，以免影響分離和鑒別效果，必要時(shí)可作特殊處理后再用。 試樣經(jīng)層析后可用比移值（Rf）表示各組成成分的位置（比移值=原點(diǎn)中心至色譜斑點(diǎn)中心的距離與原點(diǎn)中心至流動(dòng)相前沿的距離之比），由于影響比移值的因素較多，因此一般采用在相同實(shí)驗條件下對照物質(zhì)對比以確定其異同。作為單體鑒別時(shí)，試樣所顯主色譜斑點(diǎn)的顏色（或熒光）與供置，應與對照（標準）樣所顯主色的譜斑點(diǎn)或供試品-對照品（1∶1）混合所顯的主色譜斑點(diǎn)相同。作為質(zhì)量指標（純度）檢查時(shí)，可取一定量的試樣，經(jīng)展開(kāi)后，按各單體的規定，檢視其所顯雜質(zhì)色譜斑點(diǎn)的個(gè)數或呈色（或熒光）的強度。作為含量測定時(shí)，可將色譜斑點(diǎn)剪下洗脫后，再用適宜的方法測定，也可用色譜掃描儀測定。 1、下行法 所用色譜缸一般為圓形或長(cháng)方形玻璃缸，缸上有磨口玻璃蓋，應能密閉，蓋上有孔，可插入分液漏斗，以加入流動(dòng)相。在近缸頂端有一用支架架起的玻璃槽作為流動(dòng)相的容器，槽內有一玻璃棒，用以支持色譜濾紙使其自然下垂，避免流動(dòng)相沿濾紙與溶劑槽之間發(fā)生虹吸現象。 取適當的色譜濾紙按纖維長(cháng)絲方向切成適當大小的紙條，離紙條上端適當的距離（使色譜紙上端能足夠浸入溶劑槽內的流動(dòng)相中，并使點(diǎn)樣基線(xiàn)能在溶劑槽側的玻璃支持棒下數厘米處）用鉛筆劃一點(diǎn)樣基線(xiàn)，必要時(shí)色譜紙下端可切成鋸齒形，以便于流動(dòng)相滴下。 將試樣溶于適當的溶劑中，制成一定濃度的溶劑。用微量吸管或微量注射器吸取溶劑，點(diǎn)于點(diǎn)樣基線(xiàn)上，溶液宜分次點(diǎn)加，每次點(diǎn)加后，俟其自然干燥、低溫烘干或經(jīng)溫熱氣流吹干。樣點(diǎn)直徑一般不超過(guò)0.5cm，樣點(diǎn)通常應為圓形。 將點(diǎn)樣后的色譜濾紙上端放在溶劑槽內，并用玻璃棒壓住，使色譜紙通過(guò)槽側玻璃支持棒自然下垂，點(diǎn)樣基線(xiàn)在支持棒下數厘米處。色譜開(kāi)始前，色譜缸內用各單體中所規定的溶劑的蒸氣飽和，一般可在色譜缸底部放一裝有流動(dòng)相的平皿，或將浸有流動(dòng)相的濾紙條附著(zhù)在色譜缸的內壁上，放置一定時(shí)間，俟溶劑揮發(fā)使缸內充滿(mǎn)飽和蒸氣。然后添加流動(dòng)相，使浸沒(méi)溶劑槽內濾紙，流動(dòng)相即經(jīng)毛細管作用沿濾紙移動(dòng)進(jìn)行展開(kāi)至規定距離后，取出濾紙，標明流動(dòng)相前沿位置，俟流動(dòng)相揮散后按規定方法檢出色譜斑點(diǎn)。 2、上行法 色譜缸基本和下行法相似，唯除去溶劑槽和支架，并在色譜缸蓋上的孔中加塞，塞中插入玻璃懸鉤，以便將點(diǎn)樣后的色譜濾紙掛在鉤上。色譜濾紙一般長(cháng)約25cm，寬度則視需要而定。必要時(shí)可將色譜濾紙卷成筒形。點(diǎn)樣基線(xiàn)距底邊約2.5cm，點(diǎn)樣方法與下行法相同。色譜缸內加入適量流動(dòng)相，放置，俟流動(dòng)相蒸氣飽和后，再下降懸鉤，使色譜濾紙浸入流動(dòng)相約0.5cm，流動(dòng)相即經(jīng)毛細管作用沿色譜濾紙上升，除另有規定外，一般展開(kāi)至15cm后，取出晾干，按規定方法檢視。 色譜可以向一個(gè)方向進(jìn)行，即單向色譜；也可進(jìn)行雙向色譜，即先向一個(gè)方向展開(kāi)，取出，俟流動(dòng)相*揮發(fā)后，將濾紙轉90°，再用原流動(dòng)相或另一種流動(dòng)相進(jìn)行展。亦可多次展開(kāi)，連續展或徑向色譜等。薄層色譜法 按各單體所規定的載體，放入適當容器，加入適量水以配成懸浮液，在厚度均勻一致的50×200mm或200×200mm平滑玻璃板上將此懸浮液均布成0.25mm的厚度，風(fēng)干后一般在110度下干燥0.5-1h（或按單體規定）。 以離薄層板一端約25mm的位置作為點(diǎn)樣基線(xiàn)，用微量吸管按規定量吸取試樣液和對照（標準）液，點(diǎn)于基線(xiàn)上，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離在10mm以上，液點(diǎn)的直徑約3mm，風(fēng)干后，基線(xiàn)一端向下，將薄層板放入展開(kāi)溶劑，溶劑層深10mm，并預經(jīng)開(kāi)展溶劑的蒸汽飽和。在展開(kāi)溶劑從基線(xiàn)上升至規定距離（一般為15cm）后，取出薄層板，風(fēng)干，然后按規定的方法，對斑點(diǎn)的位置和顏色進(jìn)行檢查。氣相色譜法 氣相色譜法是在以適當的固定相做成的柱管內，利用氣體（載氣）作為移動(dòng)相，使試樣（氣體、液體或固體）在氣體狀態(tài)下展開(kāi)，在色譜柱內分離后，各種成分先后進(jìn)入檢測器，用記錄儀記錄色譜譜圖。 在對裝置進(jìn)行調試后，按各單體的規定條件調整柱管、檢測器、溫度和載氣流量。進(jìn)樣口溫度一般應高于柱溫30-50度。如用火焰電離檢測器，其溫度應等于或高于柱溫，但不得低于100度，以免水汽凝結。色譜上分析成分的峰的位置，以滯留時(shí)間（從注入試樣液到出現成分zui高峰的時(shí)間）和滯留容量（滯留時(shí)間×載氣流量）來(lái)表示。這些在一定條件下，就能反應出物質(zhì)所具有特殊值，并據此確定試樣成分。 根據色譜上出現的物質(zhì)成分的峰面積或峰高進(jìn)行定量。峰面積可用面積測定儀測定，按半寬度法求得（即以峰1/2處的峰寬×峰高求得）。峰高的測定方法是從峰高的頂點(diǎn)向記錄紙橫座標準垂線(xiàn)，找出此垂線(xiàn)與峰的兩下端聯(lián)結線(xiàn)的交點(diǎn)，即以此交點(diǎn)至峰頂點(diǎn)的距離長(cháng)度為峰高。定量方法可分以下三種： 1、內標準法 取標準被測成分，按依次增加或減少的已知階段量，各自分別加入各單體所規定的定量?jì)葮藴饰镔|(zhì)中，調制標準溶液。分別取此標準液的一定量注入色譜柱，根據色譜圖取標準被測成分的峰面積和峰高和內標物質(zhì)的峰面積和峰高的比例為縱座標，取標準被測成分量和內標物質(zhì)量之比，或標準被測成分量為橫坐標，制成標準曲線(xiàn)。 然后按單體中所規定的方法調制試樣液。在調制試樣液時(shí)，預先加入與調制標準液時(shí)等量的內標物質(zhì)。然后按制作標準曲線(xiàn)時(shí)的同樣條件下得出的色譜，求出被測成分的峰面積或峰高和內標物質(zhì)的峰積或峰高之比，再按標準曲線(xiàn)求出被測成分的含量。 所用的內標物質(zhì)，應采用其峰面積的位置與被測成分的峰的位置盡可能接近并與被測成分以外的峰位置*分離的穩定的物質(zhì)。 2、標準曲線(xiàn)法 取標準被測成分 按依次增加或減少階段法，各自調制成標準液，注入一定量后，按色譜圖取標準被測成分的峰面積或峰高為縱座標，而以標準被測成分的含量為橫坐標，制成標準曲線(xiàn)。然后按單體中所規定的方法制備試樣液。取試樣液按制標準曲線(xiàn)時(shí)相同的條件作出色譜，求出被測成分的峰面積和峰高，再按標準曲線(xiàn)求出被測成分的含量。 3、峰面積百分率法 以色譜中所得各種成分的峰面積的總和為100，按各成分的峰面積總和之比，求出各成分的組成比率。氣液色譜法 這時(shí)所指的氣液色譜法，主要用于各種香料物質(zhì)的分析，基本條件和參數主要依照美國精油協(xié)會(huì )（EOA）于1979年所建議的方法。其基本原理、操作、標準狀態(tài)等均與上述氣相色譜法相同。 1、柱 用304號合金所制不銹鋼管，長(cháng)3m，內徑2.16-2.57mm，外徑3.18mm。底物：極性柱為聚乙二醇20M（Carbowax 20M）,分子量約2萬(wàn)；非極性柱為氣相色譜級甲基硅氧烷（SE-30），或二甲基硅氧烷（OV-1或OV-101）。底物濃度：重量的105。固體載體：10目或20目熔融煅燒過(guò)的硅藻土，經(jīng)硅烷化和酸洗后，其自由傾落密度為0.2g/cm3，zui小120目，zui大80目。裝填密度每cm3應大于0.24g。 2、載氣 氦。zui低流量為每分鐘25-50ml。分析狀態(tài)極性柱：起始溫度，zui低75度；zui終溫度，zui高225度。升溫速度，每分鐘2-8度。非極性柱：起始溫度，zui低75度；zui終溫度，不超過(guò)275度；升溫速度，每分鐘2-8度。進(jìn)樣溫度：225-250度。試樣量：0.1-1ul。檢測器：用熱導池。檢測器的操作條件應維持恒定。